Nat Commun︱程亦凡团队运用融合蛋白策略和冷冻电镜技术成功解析G蛋白偶联受体非激活构象
撰文︱张凯华
责编︱王思珍,方以一
编辑︱方以一
作为跨膜蛋白的最大家族,G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptors,GPCRs)识别的信号分子种类繁多,如离子、多肽和脂类等,这类受体介导的信号通路与诸多生命活动和病理现象密切相关。据统计,30-40%上市药靶向GPCRs[1]。毋庸置疑,GPCR家族的三维结构信息极大地促进了对GPCRs生物学功能的认识和靶向GPCR的药物研发。与传统的晶体学手段相比,冷冻电镜技术(cryo-EM)在解析生物大分子高分辨率结构方面具有明显优势,例如无须获得晶体、所需样品量小和样品制备方式多样等,且已被广泛用于解析激活GPCR与下游蛋白的复合物结构。然而,约85% GPCRs的大部分区域包埋在脂膜环境中,这导致非激活GPCRs在未结合下游蛋白时其冷冻电镜数据处理仍具有十分重大的挑战。因此,通过生化手段改善GPCR蛋白表现将极大地促进冷冻电镜技术在解析GPCRs非激活状态上的应用,从而加深对GPCRs不同生理状态和生物学功能的理解。
2022年7月28日,加州大学旧金山分校程亦凡(Yifan Cheng)教授团队联合Aashish Manglik教授团队在Nature Communications上发表了题为“Fusion protein strategies for cryo-EM study of G protein-coupled receptors”的文章。作者选用两种不同的融合蛋白(即BRIL和PGS)分别整合到一个class A GPCR(A2AR)和一个class F GPCR(SMO)的第三个胞内环区(the third intracellular loop,ICL3),解析了它们的高分辨率电镜结构(3.4 Å和3.7 Å),且在这两种受体上均发现了结合在新位点的脂质分子。此工作也探讨了不同的表达载体设计,这为结合融合蛋白策略和cryo-EM技术的GPCRs(甚至是其他小型膜蛋白)结构解析提供了有价值的思路。
基于BRIL/anti-BRIL Fab策略[2],该团队首先将融合蛋白BRIL两端以连续螺旋的方式插入到A2AR的ICL3 [3],并加入anti-BRIL抗体片段(Fab)以获得A2AR-BRIL/anti-BRIL Fab的复合物。同时,作者也制备了未加入抗体的A2AR-BRIL样品。二者的结构解析结果说明单独的BRIL(~10 kDa)很难帮助获得GPCR的高分辨率电镜结构,而添加结构特征明显的anti-BRIL Fab能有效地帮助样品的数据处理。根据解析的高分辨率A2AR-BRIL/anti-BRIL Fab复合物结构,作者清楚地展示了结合口袋里的小分子配体和在新结合位点的脂质分子(图1)。
图1 复合物A2AR-BRIL/anti-BRIL Fab的冷冻电镜结构
(图源:Zhang, K., et al., Nat Commun, 2022)
研究者以相似的表达载体构建方式将融合蛋白BRIL插入到另一GPCR(即SMO)的ICL3 [4],但不同的是BRIL的N末端以连续螺旋的方式连接,而C末端为灵活的loop。不管是SMO-BRIL还是SMO-BRIL/anti-BRIL Fab样品,研究者都未能获得较理想的三维重构结果,这提示着在未对融合蛋白另一末端连接进行优化时,只有一末端的连续螺旋式连接不足以获得稳定的蛋白复合物,且anti-BRIL Fab(~50 kDa)的存在极有可能加重了BRIL相对于SMO的灵活性,从而无法有效地帮助数据处理。为进一步拓展融合蛋白策略的应用,研究者通过在C末端设计两种长度不一的linker,将另一种融合蛋白PGS(~20 kDa)插入到SMO的ICL3。根据AlphaFold的预测模型,这两种表达载体(construct 1 和construct 2)的结构均显示PGS C末端通过连续螺旋的方式连接到受体,只是因为linker的长度不同而导致了PGS相对于SMO的走向不同。研究者解析了construct 1 和construct 2的冷冻电镜结构,分辨率分别在6.7 Å和3.7 Å。Construct 1的结构预测模型与实验解析的结构吻合,而construct 2预测结构中的PGS走向与实验结构中的有明显差异。结构分析显示,这是由于融合蛋白PGS C末端的连接在construct 2中为长loop而非预测的连续螺旋,这一灵活的长loop允许PGS采取合适的走向从而与SMO形成疏水性相互作用。二者间的疏水性相互作用极大地稳定了SMO-PGS复合物,进而有利于它的结构解析。研究者也在其他两种GPCRs的晶体结构中发现了类似的疏水性相互作用(图2)。这些结果提示了PGS与SMO形成稳定复合物的情形很有可能也适用于其他GPCRs,这种策略有望被应用于解析和阐明其他GPCRs的结构和功能。
图2 融合蛋白PGS分别与三种GPCRs(SMO/MC4R/MT1)形成疏水性相互作用
(图源:Zhang, K., et al., Nat Commun, 2022)
论文链接:https://www.nature.com/articles/s41467-022-32125-2
该论文通讯作者是美国加州大学旧金山分校的程亦凡(Yifan Cheng)教授和Aashish Manglik教授。张凯华博士是本文第一作者。张凯华博士刚加入复旦大学脑科学转化研究院成立课题组并担任独立PI,相关招聘信息详见https://itbr.fudan.edu.cn/info/1263/3004.htm。
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参考文献
[1] Hauser, A. et al. Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications. Nat Rev Drug Discov 16, 829–842 (2017).
[2] Tsutsumi, N. et al. Structure of human Frizzled5 by fiducial-assisted cryo-EM supports a heterodimeric mechanism of canonical Wnt signaling eLife 9, e58464 (2020).
[3] Liu, W. et al. Structural basis for allosteric regulation of GPCRs by sodium ions. Science 337, 232–236 (2012).
[4] Wang, C. et al. Structural basis for Smoothened receptor modulation and chemoresistance to anticancer drugs. Nat. Commun. 5, 4355 (2014).
本文完